全自动蛋白免疫印迹处理系统在实验中可能出现的常见问题主要包括信号弱或无信号、背景高、多带现象、条带异常等，以下是对这些问题的详细分析：
信号弱或无信号
一抗和二抗不匹配：二抗需和一抗宿主的物种相同，例如一抗来自鼠，二抗则应是抗鼠抗体。
抗体浓度不足：使用高浓度抗体，并在4℃条件下延长孵育时间，如过夜孵育。
封闭剂与抗体交叉反应：使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（如脱脂奶粉、BSA、血清、明胶）。
一抗不识别待检物种的蛋白：参照说明书，对比免疫原序列和蛋白序列，确保抗体和目的蛋白会发生反应，并设置阳性对照。
蛋白上样量不足：每条泳道蛋白上样量一般不超过20μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。
转膜不充分：使用可逆染色剂检测转膜效果，检查转膜操作是否正确，如PVDF膜需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。
一抗失效：使用新鲜抗体，避免重复使用导致有效浓度降低。
二抗受叠氮钠抑制：避免叠氮钠和HRP标记抗体一起使用。
检测试剂盒过期或底物失活：使用新鲜的底物。
背景高
未进行特异性封闭或封闭不充分：延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。
一抗或二抗浓度过高：稀释抗体至合适浓度，或以更高稀释度抗体延长孵育时间。
二抗与封闭剂非特异性结合或反应：设置二抗对照（不加一抗）。
未结合蛋白质洗涤不充分：增加洗涤次数。
膜干燥：在孵育过程中防止膜变干，每一步都要保证膜有充分的反应液，可放入搅拌子不断搅动或轻轻震荡使膜浸在溶液中。
选膜不当：硝酸纤维素膜（NC膜）比PVDF膜背景低，可根据实验需求选择合适的膜。
多带现象
细胞传代次数过多，蛋白表达不同：使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。
体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式：如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等，可使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来证明翻译后的修饰。
蛋白样本降解：在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。
检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白：查阅其他文献报道，或使用BLAST搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。
一抗浓度过高：降低抗体浓度和/或孵育时间。
条带异常
背景有不均匀的白色斑点：转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均，转膜过程中应尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动。
背景有黑色斑点：抗体结合了封闭剂，可过滤封闭剂。
深背景出现白色条带：一抗或二抗加入过多，应稀释抗体的浓度。
目的条带染色过低/过高，分离不彻底：改变凝胶比例，分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶。
条带“微笑”效应：迁移过快或电泳温度过高改变了pH值和迁移速度，可降低迁移速度或低温电泳（如在冷库或冰上进行）。
相同蛋白杂交出现不均匀条带：制备凝胶时凝胶凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均匀，可参照凝胶的配方，在凝胶中加入适量TEMED，放置时在凝胶顶部加入适量1%SDS（水稀释）以防凝胶变干。
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